辛辛苦苦提完 RNA,逆轉(zhuǎn)錄后一個個孔加完引物和模板,Z后進行 RT-PCR,你以為這樣就可以美滋滋地坐等結(jié)果了?等到一幅下面這樣的結(jié)果圖,不知道對于剛接觸 RT-PCR 的你來說內(nèi)心是否是崩潰的?
這是啥?怎么看?
別急,讓我慢慢跟你介紹,看完后你就能準確的分析出你的 RT-PCR 結(jié)果了?!高@里以 7500 軟件為例進行介紹」
1. 首先設置好內(nèi)參和對照組「在 Analysis Settings 處」,一般我們在上機前會對應設置好的,如果設置好的話可以直接跳至第 3 點。如果沒有設置好的話是需要重新進行設置。
2. 點擊進去后,選擇對應好的內(nèi)參和對照組?!冈?Relative Quantization Settings 選項下」
3.選擇好內(nèi)參和對照組后,我們首先看看 PCR 跑的有沒有問題,在這里大家Z常會見到的問題是在樣品池出現(xiàn)了三角形符號,如下圖:
那么這些三角形代表什么意思?沒錯,聰明的你應該已經(jīng)想到是這個孔出現(xiàn)了問題,而三角形中的數(shù)字是幾則代表了孔中有幾個問題。具體又是什么問題呢?我們就要通過 analysis 中的 QC Summery 進行查找。
舉個栗子,比如圖中的 A9 孔,出現(xiàn)了 2,則表示有 2 個問題,第 1 個問題如上圖所示,High standard deviation 高的標準偏差,表示可能是你上樣時導致的樣品復孔之間差異較大。第二個問題則是下圖中,系統(tǒng)認定 A9 孔中的數(shù)值偏差較大,屬于異常值。
當然,還有比較常見的問題是引物二聚體引起的雙重峰,如 A4 孔。
4. 溶解曲線「melt curve」:表示隨溫度升高 DNA 的雙螺旋結(jié)構(gòu)降解程度的曲線。總的 DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)降解一半的溫度稱為熔解溫度「Tm」,不同序列的 DNA,Tm 值不同。DNA 中 G-C 含量越高,Tm 值越高,成正比關系。正如上面提到的,正常的樣品孔溶解曲線應該是單峰的,如下圖。如果出現(xiàn)了雙峰,則要考慮是否引物設計不合理或者引物過量引起溶解曲線出現(xiàn)多峰的情況。
5. 如果前面的幾項都沒有太大的問題的話。Z后我們看看Z重要的結(jié)果,也就是目的基因的變化情況了。在內(nèi)參與對照組選擇沒錯的情況下,點擊 gene expression 選項,選中你想查看的樣品孔的基因表達情況。
好了,這次的 RT-PCR 看圖分析就到這里。Z后需要注意的是圖中的結(jié)果還需要輸出進行后續(xù)的自行運算得出結(jié)果。圖中的結(jié)果只能給出參考。但大致趨勢是相同的,如果還有童鞋想聽后續(xù)如何計算 RT-PCR 的結(jié)果及原理的話,歡迎關注下期的 RT-PCR 結(jié)果的計算原理與計算模板。
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