基礎(chǔ)篇-無(wú)菌操作基本技術(shù)

1. 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前，無(wú)菌室及無(wú)菌操作臺(tái)(laminar flow) 以紫外燈照射30-60 分鐘滅菌，以70% ethanol擦拭無(wú)菌操作抬面，并開(kāi)啟無(wú)菌操作臺(tái)風(fēng)扇運(yùn)轉(zhuǎn)10 分鐘后，才開(kāi)始實(shí)驗(yàn)操作。每次操作只處理一株細(xì)胞株，且即使培養(yǎng)基相同亦不共享培養(yǎng)基，以避免失誤混淆或細(xì)胞間污染。實(shí)驗(yàn)完畢后，將實(shí)驗(yàn)物品帶出工作臺(tái)，以70% ethanol 擦拭無(wú)菌操作抬面。操作間隔應(yīng)讓無(wú)菌操作臺(tái)運(yùn)轉(zhuǎn)10分鐘以上后，再進(jìn)行下一個(gè)細(xì)胞株之操作。

2. 無(wú)菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時(shí)放置，其它實(shí)驗(yàn)用品用完即應(yīng)移出，以利于氣流之流通。實(shí)驗(yàn)用品以70% ethanol擦拭后才帶入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在抬面之中央無(wú)菌區(qū)域，勿在邊緣之非無(wú)菌區(qū)域操作。

3. 小心取用無(wú)菌之實(shí)驗(yàn)物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打開(kāi)之容器正上方操作實(shí)驗(yàn)。容器打開(kāi)后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45°角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。

4. 工作人員應(yīng)注意自身之安全，須穿戴實(shí)驗(yàn)衣及手套后才進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對(duì)于來(lái)自人類或是病毒感染之細(xì)胞株應(yīng)特別小心操作，并選擇適當(dāng)?shù)燃?jí)之無(wú)菌操作臺(tái)（至少Class II）。操作過(guò)程中，應(yīng)避免引起aerosol之產(chǎn)生，小心毒性藥品，例如DMSO及TPA等，并避免尖銳針頭之傷害等。

5. 定期檢測(cè)下列項(xiàng)目：

5.1. CO2鋼瓶之CO2壓力。

5.2. CO2培養(yǎng)箱之CO2濃度、溫度、及水盤(pán)是否有污染(水盤(pán)的水用無(wú)菌水，每周更換)。 

5.3. 無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)之a(chǎn)irflow壓力，定期更換紫外線燈管及HEPA過(guò)濾膜，預(yù)濾網(wǎng)(300小時(shí)/預(yù)濾網(wǎng)，3000小時(shí)/HEPA)。

6. 水槽可添加消毒劑（Zephrin 1:750），定期更換水槽的水。

基礎(chǔ)篇-實(shí)驗(yàn)用品

1. 種類：

1.1. 細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)用品均為無(wú)菌，除了玻璃容器與pasteur pipet外，其它均為塑料無(wú)菌制品。 

1.2. TC級(jí)培養(yǎng)盤(pán)表面均有coating高分子物質(zhì)以讓細(xì)胞吸附，培養(yǎng)容器種類有Tflask，plates, dishes, roller bottle等，依實(shí)驗(yàn)需要使用。

1.3. plastic sterile pipet: 1 ml, 2 ml,5 ml, 10 ml, 25 ml

1.4. 塑料離心管：15 ml, 50 ml，均有2 種不同材質(zhì)，其中polypropylene (PP)為不透明材質(zhì)，polystyrene (PS)為透明材質(zhì)，可依實(shí)驗(yàn)需要而選擇適合材質(zhì)之離心管。

1.5. glass pastuer pipet: 9 inch，用以抽掉廢棄培養(yǎng)液等。

1.6. 玻璃血清瓶(Pyrex or Duran glassware)：100ml，250ml，500ml，1000ml。

2. 清洗：

2.1. 新購(gòu)玻璃血清瓶先以0.1~0.05 N HCl 浸泡數(shù)小時(shí)，洗凈后才開(kāi)始使用。

2.2. 用過(guò)之玻璃血清瓶，以高壓蒸汽滅菌，洗凈后分別用一次與二次去離子水沖洗干凈，勿加清潔劑清洗。

3. 滅菌：

3.1. 實(shí)驗(yàn)用玻璃血清瓶以鋁箔紙包覆瓶蓋，高壓蒸汽滅菌121℃, 15 lb, 20 分鐘，置于oven中烘干。

3.2. 實(shí)驗(yàn)用玻璃pasteur pipet以干熱滅菌170℃, 4 小時(shí)。

3.3. 液體或是固體廢棄物可用10 % hypochloride溶液(次氯酸，即漂白水) 或是蒸汽高壓滅菌121 ℃, 15 lb, 20 分鐘處理。

基礎(chǔ)篇-培養(yǎng)基

1. 液體培養(yǎng)基貯存于4℃ 冰箱，避免光照，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前放在37℃ 水槽中溫?zé)帷?

2. 液體培養(yǎng)基（加血清）存放期為六個(gè)月，期間glutamine可能會(huì)分解，若細(xì)胞生長(zhǎng)不佳，可以再添加適量glutamine。

3. 粉末培養(yǎng)基配制(以1 升為例)：

3.1. 細(xì)胞培養(yǎng)基通常須添加10%血清，因此粉末培養(yǎng)基之配制體積為900 ml，pH為7.2-7.4。NaHCO3 為另外添加，若將NaHCO3粉末直接加入液體培養(yǎng)基中會(huì)造成pH之誤差，或局部過(guò)堿。因此粉末培養(yǎng)基及NaHCO3粉末應(yīng)分別溶解后才混合，然后用CO2氣體調(diào)整pH，而非用強(qiáng)酸(HCl)或強(qiáng)堿(NaOH)，因?yàn)槁入x子對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)可能有影響，且貯存時(shí)培養(yǎng)基的pH易發(fā)生改變。 

3.2. 材料：

純水（milli-Q水或二次至三次蒸餾水，水品質(zhì)非常重要），粉末培養(yǎng)基，NaHCO3，電磁攪拌器，無(wú)菌血清瓶，0.1或0.2 mm無(wú)菌過(guò)濾膜，pH計(jì)，真空泵，CO2氣體

3.3. 步驟：

3.3.1. 取粉末培養(yǎng)基溶于700 ml milli-Q水中，攪拌使其溶解。

3.3.2. 稱取適量之NaHCO3粉末溶于200ml milli-Q水中，攪拌使其溶解，然后通入CO2 氣體至飽和，約3-5分鐘。

3.3.3. 將溶解且含飽和CO2之NaHCO3溶液加入溶解之液體培養(yǎng)基中混合。混后溶液之pH應(yīng)為7.2-7.4，除非pH值偏差太大，否則不需用酸堿再調(diào)整之。若為太堿，可再通入CO2氣體調(diào)整pH。培養(yǎng)基以真空幫浦通過(guò)過(guò)濾膜時(shí)，pH會(huì)升高0.1-0.2。

3.3.4. 以0.1或0.2 mm 無(wú)菌過(guò)濾膜過(guò)濾滅菌，同時(shí)分裝至無(wú)菌容器中，標(biāo)示培養(yǎng)基種類、日期、瓶號(hào)等，貯存于4℃。(血清亦可加入培養(yǎng)基中一起過(guò)濾)

3.3.5. 配制之培養(yǎng)基配制須作生長(zhǎng)試驗(yàn)與污染測(cè)試。

附-配制培養(yǎng)基之生長(zhǎng)測(cè)試

材料：

MDCK cell (ATCC CCL-34 或CCRC 60004)

6-well TC plate (or 35 mm TC dish)

methanol

glacial acetic acid

10 % Giemsa solution (GibcoBRL 10092-013)

步驟：

1. 以待測(cè)試培養(yǎng)基培養(yǎng)MDCK cell，接種MDCK 細(xì)胞于6-well plate (或35mm TC dish) 中，每個(gè)well 接種1 × 102 活細(xì)胞，同時(shí)作對(duì)照組實(shí)驗(yàn)。

2. 接種5～7 天后，在100 倍倒立顯微鏡作觀察細(xì)胞群落之生長(zhǎng)，待細(xì)胞群落大到可以肉眼觀察，而群落間不互相接觸時(shí)即可。

3. 去除培養(yǎng)基，加入1 ml Carnoy’s 固定液(甲醇：冰醋酸﹦ 3:1)，室溫下靜置10 min。

4. 去除固定液，水洗二次。

5. 加入1 ml 10 % Giemsa solution，，室溫下靜置染色2-3 min。

6. 去除染液，水洗二次。

7. 以肉眼計(jì)數(shù)群落數(shù)，并比較之，若新配制或新批號(hào)的培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)不佳，則丟棄之。

基礎(chǔ)篇-抗生素

1. 細(xì)胞庫(kù)之細(xì)胞培養(yǎng)基不加抗生素

1.1. 培養(yǎng)自ATCC 引進(jìn)之細(xì)胞株，培養(yǎng)基中不加抗生素。

1.2. 培養(yǎng)自其它實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)之細(xì)胞株，制作token freeze前培養(yǎng)基須添加抗生素，待token freeze通過(guò)污染測(cè)試后，大量培養(yǎng)時(shí)則不加抗生素。 

2. 寄送活細(xì)胞時(shí)，須將培養(yǎng)液充滿整個(gè)flask時(shí)，則須添加抗生素(penicillin 100 units/ml + streptomycin 100 ug/ml)。

3. 若要檢測(cè)mycoplasma，則培養(yǎng)基內(nèi)不可添加gentamicin，因gentamicin會(huì)抑制mycoplasma生長(zhǎng)。

4. 去除細(xì)菌污染之抗生素混合配方：penicillin 250units/ml, streptomycin 250ug/ml, neomycin 250ug/ml, bacitracin 2.5units/ml，注意混合使用后藥物毒性會(huì)增強(qiáng)。 

5. 抗生素使用種類與濃度：

                                工作濃度.     儲(chǔ)存溫度.      殺滅細(xì)菌

penicillin                 100 units/ml    -20℃        G(+) bacteria

streptomycin              100 ug/ml      -20℃        G(+) and G(-) bacteria

chlotetracycline            50 ug/ml       -20℃        G(+) and G(-) bacteria

gentamicin                50 ug/ml       -20℃        G(+) and G(-) bacteria, mycoplasma

amphotericin B             2.5 ug/ml      -20℃        yeast and molds

nystatin                   50 ug/ml       -20℃        yeast and molds

fungizone                 2.5ug/ml       -20℃        yeast and molds

基礎(chǔ)篇-血清

1. 血清必須貯存于–20～–70℃，若存放于4℃，請(qǐng)勿超過(guò)一個(gè)月。如果一次無(wú)法用完一瓶，可將40～45ml 分裝于無(wú)菌50ml離心管中，由于血清結(jié)凍時(shí)體積會(huì)增加約10 %， 必須預(yù)留此膨脹體積之空間，否則易發(fā)生污染或容器凍裂之情形。 

2. 一般廠商提供之血清為無(wú)菌，不需再無(wú)菌過(guò)濾。若發(fā)現(xiàn)血清有許多懸浮物，則可將血清加入培養(yǎng)基內(nèi)一起過(guò)濾，勿直接過(guò)濾血清。

3. 瓶裝(500ml) 血清解凍步驟(逐步解凍法)：–20℃或–70℃至4℃冰箱溶解一天，至室溫下全溶后再分裝，一般以50ml無(wú)菌離心管可分裝40～45 ml。在溶解過(guò)程中須規(guī)則搖晃均勻(小心勿造成氣泡)，使溫度與成分均一，減少沉淀的發(fā)生。勿直接由–20℃直接至37℃解凍，因溫度改變太大，容易造成蛋白質(zhì)凝結(jié)而發(fā)生沈淀。

4. heat-inactivation 是指56℃, 30 分鐘加熱已*解凍之血清。加熱過(guò)程中須規(guī)則搖晃均勻。此熱處理之目的是使血清中之補(bǔ)體成份(complement) 去活化。除非必須，一般不建議作此熱處理，因?yàn)闀?huì)造成沉淀物之顯著增多，且會(huì)影響血清之品質(zhì)。補(bǔ)體參與之反應(yīng)有：cytolytic activities, contraction of smooth muscle, release of histamine from mast cells and platelets, enhanced phagocytosis, chemotaxis and activation of lymphocytic and macrophage cell type。

5. 勿將血清置于37℃太久，若在37℃放置太久，血清會(huì)變得混濁，同時(shí)血清中許多較不穩(wěn)定之成份亦會(huì)因此受到破壞，而影響血清之品質(zhì)。

6. 血清之沉淀物

6.1. 凝絮物：發(fā)生之原因有許多種，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein) 變性及解凍后血清中存在之血纖維蛋白(fibrin) 造成，這些凝絮沉淀物不會(huì)影響血清本身之品質(zhì)。若欲減少這些凝絮沉淀物，可用離心3000rpm, 5min去除，或離心后上清液可以加入培養(yǎng)基中一起過(guò)濾。不建議用過(guò)濾步驟去除這些凝絮沈淀物，因?yàn)闀?huì)阻塞過(guò)濾膜。

6.2. 顯微鏡下觀察之“小黑點(diǎn)”：通常經(jīng)過(guò)熱處理之血清，沉淀物的形成會(huì)顯著的增多。有些沉淀物在顯微鏡下觀察像是“小黑點(diǎn)”，常會(huì)誤認(rèn)為血清遭受污染，而將血清放在37℃中欲培養(yǎng)此“微生物“，但在37℃環(huán)境下，又會(huì)使此沉淀物增多，更會(huì)誤認(rèn)為微生物之增殖，但以培養(yǎng)細(xì)菌之培養(yǎng)基檢測(cè)，又沒(méi)有污染。一般而言，此小黑點(diǎn)應(yīng)不會(huì)影響細(xì)胞之生長(zhǎng)，但若懷疑此血清之品質(zhì)，應(yīng)立即停用，更換另一批號(hào)的血清。

附-血清之生長(zhǎng)測(cè)試

材料：

MDCK cell (ATCC CCL-34 或CCRC 60004)

a-MEM (alpha modified minimal essential medium, GibcoBRL 12000-022 )

6-well TC plate (or 35mm TC dish)

methanol

glacial acetic acid

10 % Giemsa solution(GibcoBRL 10092-013)

步驟：

1. 以a-MEM with 10 % FBS (已測(cè)試過(guò)) 培養(yǎng)MDCK 細(xì)胞于T75 flask 至80% confluency。

2. 以trypsin-EDTA 處理細(xì)胞，離心后，加入適量不加血清之a(chǎn)-MEM 制成細(xì)胞懸浮液，并測(cè)細(xì)胞濃度。以不加血清之a(chǎn)-MEM 稀釋細(xì)胞濃度為1×102活細(xì)胞數(shù)/ ml。

3. 將1 ml 細(xì)胞懸浮液接種入6-well plate 中，并另加入1 ml 含不同濃度的血清(20 % , 10 % , 4 % , 2 % , 1 % , 0.4 %) 之a(chǎn)-MEM，使血清終濃度為10% , 5 % , 2 % , 1 % , 0.5 % , 0.2 %。用已測(cè)試過(guò)之血清同時(shí)進(jìn)行對(duì)照組試驗(yàn)。

4. 37 oC，5 % CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)5-7 天，期間不需更換培養(yǎng)基，待細(xì)胞群落大到可以肉眼觀察，而群落間不互相接觸即可。

5. 去除培養(yǎng)基，加入1 ml Carnoy’s 固定液(甲醇:冰醋酸﹦ 3:1)，室溫下靜置10 min。

6. 去除固定液，水洗二次。

7. 加入1 ml 10 % Giemsa solution，，室溫下靜置染色2-3 min。

8. 去除染液，水洗二次。

9. 以肉眼計(jì)數(shù)群落數(shù)

10. 計(jì)算SPE ( Serum Plating Efficiency )：

SPE = ( no. of colonies / well ) / 100 x 100 %

11. 計(jì)算RPE(Relative Plating Efficiency)：

SPE = [ total colonies of six well (test) / Total colonies of six well (control) ] x100 %

比較各濃度血清培養(yǎng)基之RPE，即可得知待測(cè)血清對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。訂購(gòu)多量同一批號(hào)的優(yōu)良血清，置于–70℃保存之

基礎(chǔ)篇-細(xì)胞傳代培養(yǎng)

1. 細(xì)胞生長(zhǎng)至高密度時(shí)，即須分殖至新的培養(yǎng)瓶中，一般稀釋比例為1:3 至1:6，依細(xì)胞種類而異。

2. 材料：

2.1. 無(wú)菌磷酸生理緩沖液(Dulbecco’s phosphate-buffered saline, Ca++/Mg++ free, D-PBS, GibcoBRL 21600-010)

2.2. trypsin-EDTA solution (0.05% trypsin-0.53mM EDTA-4Na, GibcoBRL 25300-062)：

以10ml 分裝于15ml無(wú)菌離心管中，保存于–20℃，使用前放在37℃水槽回溫。

2.3. 新鮮培養(yǎng)基

2.4. 無(wú)菌吸管/離心管/培養(yǎng)瓶

3. 步驟：

3.1. 附著型細(xì)胞（adherent cell）

3.1.1. 吸掉舊培養(yǎng)液。

3.1.2. 用D-PBS洗滌細(xì)胞一至二次。

3.1.3. 加入trypsin-EDTA 溶液(1ml/25cm2, 2ml/75cm2)，37℃作用數(shù)分鐘，于倒立顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞將要分離而呈現(xiàn)圓粒狀時(shí)，吸掉trypsin-EDTA溶液。(若不移去trypsin-EDTA，則在trypsin-EDTA作用后，加入適量含血清之新鮮培養(yǎng)基終止trypsin作用，離心后再吸掉上清液)。

3.1.4. 輕拍培養(yǎng)瓶使細(xì)胞自瓶壁脫落，加入適量之新鮮培養(yǎng)基，以吸管上下吸放數(shù)次以打散細(xì)胞團(tuán)塊，混和均勻后，依稀釋比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中，以正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)。

3.2. 懸浮型細(xì)胞(suspension cell)

3.2.1. 吸出細(xì)胞培養(yǎng)液，放入離心管中，離心1000 rpm 5 分鐘。

3.2.2. 吸掉上清液，加入適量之新鮮培養(yǎng)基，混和均勻后，依稀釋比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中，以正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)。

3.3. 融合瘤(hybridoma)

3.3.1. 有些hybridoma cell 需培養(yǎng)三天以上才會(huì)產(chǎn)生抗體，若是更換培養(yǎng)基，則可能會(huì)失去抗體。因此繼代培養(yǎng)不需離心后更換培養(yǎng)基，直接添加新鮮培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞濃度即可。若體積太大，可傾斜放置，或分殖至新培養(yǎng)瓶中。

基礎(chǔ)篇-細(xì)胞冷凍保存

1. 注意事項(xiàng)：

1.1. 欲冷凍保存之細(xì)胞應(yīng)在生長(zhǎng)良好（log phase）且存活率高之狀態(tài)，約為80–90％致密度。

1.2. 冷凍前檢測(cè)細(xì)胞是否仍保有其特有性質(zhì)，例如hybridoma應(yīng)在冷凍保存前一至二日測(cè)試是否有抗體之產(chǎn)生。

1.3. 注意冷凍保護(hù)劑之品質(zhì)。DMSO應(yīng)為試劑級(jí)等級(jí)，無(wú)菌且無(wú)色(以0.22micronFGLP Telflon過(guò)濾或是直接購(gòu)買(mǎi)無(wú)菌產(chǎn)品，如Sigma D-2650)，以5~10 ml小體積分裝，4℃避光保存，勿作多次解凍。Glycerol 亦應(yīng)為試劑級(jí)等級(jí)，以高壓蒸汽滅菌后避光保存。在開(kāi)啟后一年內(nèi)使用，因長(zhǎng)期儲(chǔ)存后對(duì)細(xì)胞會(huì)有毒性。

1.4. 冷凍保存之細(xì)胞濃度：

1.4.1. normal human fibroblast: 1~3*106 cells/ml

1.4.2. hybridoma: 1~3 x 106cells/ml，細(xì)胞濃度不要太高，某些hybridoma會(huì)因冷凍濃度太高而在解凍24小時(shí)后si去。

1.4.3. adherent tumor lines: 5~7 x 106，依細(xì)胞種類而異。Adenocarcinoma 解凍后須較高之濃度，而HeLa 只需1-3 x 106cells/ml。

1.4.4. other suspensions: 5~10 x 106cells/ml, human lymphocyte 須至少5 x 106cells/ml。

1.5. 冷凍保護(hù)劑濃度為5或10％ DMSO，若是不確定細(xì)胞之冷凍條件，在做冷凍保存之同時(shí)，亦應(yīng)作一個(gè)backup culture，以防止冷凍失敗。

1.6. 冷凍方法：

1.6.1. 傳統(tǒng)方法: 4℃ 10分鐘---> -20℃ 30分鐘---> -80℃ 16-18小時(shí)(或隔夜) ---> 液氮槽vapor phase 長(zhǎng)期儲(chǔ)存。

1.6.2. 程序降溫：利用等速降溫機(jī)以–1～–3℃/分鐘之速度由室溫降至–120℃，放在液氮槽vapor phase長(zhǎng)期儲(chǔ)存。適用于懸浮型細(xì)胞與hybridoma之保存。

2. 材料：

2.1. 生長(zhǎng)良好之培養(yǎng)細(xì)胞

2.2. 新鮮培養(yǎng)基

2.3. DMSO (Sigma D-2650)

2.4. 無(wú)菌塑料冷凍保存管(Nalgene 5000-0020)

2.5. 0.4 ％ w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061)

2.6. 血球計(jì)數(shù)盤(pán)與蓋玻片

2.7. 等速降溫機(jī)(KRYO 10 Series II)

3. 步驟：

3.1. 冷凍前一日前更換半量或全量培養(yǎng)基，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情形。

3.2. 配制冷凍保存溶液(使用前配制)：將DMSO加入新鮮培養(yǎng)基中，后濃度為5-10％，混合均勻，置于室溫下待用。

3.3. 依細(xì)胞繼代培養(yǎng)之操作，收集培養(yǎng)之細(xì)胞，取少量細(xì)胞懸浮液((約0.1 ml)計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度及凍前存活率。

3.4. 離心，去除上清液，加入適量冷凍保存溶液，使細(xì)胞濃度為1-5 x 106 cells/ml，混合均勻，分裝于已標(biāo)示*之冷凍保存管中，1 ml/vial，并取少量細(xì)胞懸浮液作污染檢測(cè)。

3.5. 冷凍保存方法1: 冷凍管置于4℃ 10 分鐘→ -20℃ 30分鐘→ -80℃ 16～18小時(shí)(或隔夜)→液氮槽vapor phase長(zhǎng)期儲(chǔ)存。

3.6. 冷凍保存方法2: 冷凍管置于已設(shè)定程序之等速降溫機(jī)中，再放入液氮槽中。程序?yàn)? program 7: HB CELL

基礎(chǔ)篇-冷凍細(xì)胞活化

1. 冷凍細(xì)胞之活化原則為快速解凍，以避免冰晶重新結(jié)晶而對(duì)細(xì)胞造成傷害，導(dǎo)致細(xì)胞之死亡。

2. 細(xì)胞活化后，約需數(shù)日，或繼代一至二代，其細(xì)胞生長(zhǎng)或特性表現(xiàn)才會(huì)恢復(fù)正常(例如產(chǎn)生單株抗體或是其它蛋白質(zhì))。

3. 材料：

 37℃ 恒溫水，新鮮培養(yǎng)基，無(wú)菌吸管/ 離心管/ 培養(yǎng)瓶，液氮或干冰容器

4. 步驟：

4.1 操作人員應(yīng)戴防護(hù)面罩及手套，防止冷凍管可能爆裂之傷害。

4.2 自液氮或干冰容器中取出冷凍管，檢查蓋子是否旋緊，由于熱脹冷縮過(guò)程，此時(shí)蓋子易松掉。

4.3 將新鮮培養(yǎng)基置于37 C水槽中回溫，回溫后噴以70 % 酒精并擦拭之，移入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。

4.4 取出冷凍管，立即放入37 C 水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1分鐘內(nèi)全部融化，以70% ethanol 擦拭保存管外部，移入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。

4.5 取出0.9 ml解凍之細(xì)胞懸浮液，緩緩加入有培養(yǎng)基之培養(yǎng)容器內(nèi)(稀釋比例1:10～1:15)，混合均勻，放入CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。另取0.1 ml 解凍細(xì)胞懸浮液作存活測(cè)試。

4.6 解凍后是否立即去除冷凍保護(hù)劑(例如DMSO或glycerol)，依細(xì)胞種類而異，一般而言，大都不需要立即去除冷凍保護(hù)劑。若要立即去除，則將解凍之細(xì)胞懸浮液加入含有5-10 ml 培養(yǎng)基之離心管內(nèi)，離心1,000 rpm, 5 分鐘，移去上清液，加入新鮮培養(yǎng)基，混合均勻，放入CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

4.7 若不需立即去除冷凍保存劑，則在解凍培養(yǎng)后隔日更換培養(yǎng)基。

基礎(chǔ)篇-收到細(xì)胞的處理方式 (一)

1. 收到細(xì)胞株包裹時(shí)， 請(qǐng)檢查細(xì)胞株冷凍管是否有解凍情形，若有請(qǐng)立即通知。細(xì)胞株請(qǐng)盡速開(kāi)始培養(yǎng)，或立即冷凍保存(置于–70 C，隔夜后，移到液氮)。

2. 冷凍細(xì)胞解凍程序:

2.1. 依據(jù)細(xì)胞株數(shù)據(jù)單之基礎(chǔ)培養(yǎng)基種類、血清種類和其它之成份和比例，制備培養(yǎng)基。絕大多數(shù)之細(xì)胞均無(wú)法立即適應(yīng)不同之基礎(chǔ)培養(yǎng)基或不同之血清種類，若因?qū)嶒?yàn)需要，必須有所不同時(shí)，務(wù)必以緩慢比例漸次改變培養(yǎng)基組成，確定細(xì)胞適應(yīng)后，方進(jìn)行所需之實(shí)驗(yàn)。

2.2. FBS (fetal bovine serum, 胚牛血清), CS (calf serum, 小牛血清)和HS (horse serum, 馬血清)，對(duì)細(xì)胞而言差異極大，請(qǐng)務(wù)必依據(jù)細(xì)胞株資料單之血清種類培養(yǎng)之。

2.3. 將培養(yǎng)基置于37 C 水槽中回溫，回溫后噴以70 % 酒精并擦拭之，移入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。取出冷凍管，立即放入37 C水槽中快速解凍，水面高度不可接近或高過(guò)冷凍管之蓋沿，否則易發(fā)生污染。輕搖冷凍管使其在1分鐘內(nèi)全部融化后，以70% ethanol 擦拭冷凍管外部，移入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。

2.4. 依據(jù)細(xì)胞種類和濃度，于無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)取10ml培養(yǎng)基加至T25或T75 flask中。取出已解凍之細(xì)胞懸浮液，緩緩加入T25或T75 flask內(nèi)之培養(yǎng)基，混合均勻，放入37 C，5 % CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

2.5. 對(duì)絕大多數(shù)細(xì)胞而言，1%以下之冷凍保護(hù)劑DMSO，不會(huì)對(duì)細(xì)胞之貼附或活化有不良影響，不需立刻由解凍細(xì)胞中去除， 待第二天確定細(xì)胞生長(zhǎng)或貼附良好后再去除即可。惟對(duì)極少數(shù)因?qū)MSO 敏感或會(huì)造成細(xì)胞分化之細(xì)胞，需立即去除DMSO 者， 則可將解凍后之細(xì)胞懸浮液放入5 - 10 ml 培養(yǎng)基中，離心300 xg (約1000 rpm)，5分鐘，小心移去上清液，加入適量新鮮培養(yǎng)基，將細(xì)胞均勻混合后，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中， 再放入37 °C， 5 % CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

基礎(chǔ)篇-收到細(xì)胞的處理方式 (二)

收到T25 flask 細(xì)胞時(shí)， 處理方式為︰

1. 于寄送過(guò)程中，為避免起泡造成細(xì)胞脫落死亡，T25 flask 均加滿培養(yǎng)基。請(qǐng)檢查flask 外觀，并于顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況和有無(wú)污染現(xiàn)象，若有任何問(wèn)題， 不要打開(kāi)蓋子，請(qǐng)立即通知細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室。

2. 將原封之T25 flask 靜置于37 °C， 5 % CO2 培養(yǎng)箱中，使細(xì)胞回溫至37 °C， 并讓運(yùn)送過(guò)程中少數(shù)脫落的細(xì)胞可再附著生長(zhǎng)。隔天后，于無(wú)菌操作箱內(nèi)取出flask內(nèi)之培養(yǎng)基，(取出之培養(yǎng)基可以再使用)，僅留約5-10ml 培養(yǎng)基于flask 內(nèi)，依一般培養(yǎng)方式再將細(xì)胞置入培養(yǎng)箱中，或細(xì)胞已長(zhǎng)滿盤(pán)， 則將細(xì)胞做傳代培養(yǎng)。

附-細(xì)胞計(jì)數(shù)與存活測(cè)試

1. 原理：

1.1. 計(jì)算細(xì)胞數(shù)目可用血球計(jì)數(shù)盤(pán)或是Coulter counter粒子計(jì)數(shù)器自動(dòng)計(jì)數(shù)。

1.2. 血球計(jì)數(shù)盤(pán)一般有二個(gè)chambers，每個(gè)chamber中細(xì)刻9個(gè)1 mm2 大正方形，其中4個(gè)角落之正方形再細(xì)刻16個(gè)小格，深度均為0.1 mm。當(dāng)chamber 上方蓋上蓋玻片后，每個(gè)大正方形之體積為1 mm2 x 0.1 mm=1.0 x 10-4 ml。使用時(shí)，計(jì)數(shù)每個(gè)大正方形內(nèi)之細(xì)胞數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，再乘以104，即為每ml 中之細(xì)胞數(shù)目。

1.3. 存活測(cè)試之步驟為dye exclusion，利用染料會(huì)滲入死細(xì)胞中而呈色，而活細(xì)胞因細(xì)胞膜完整，染料無(wú)法滲入而不會(huì)呈色。一般使用藍(lán)色之trypan blue染料，如果細(xì)胞不易吸收trypan blue，則用紅色之Erythrosin bluish。

2. 材料：

0.4 % w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061)

Erythosin bluish stain

取0.1 gram Erythrosin bluish (Sigma E-9259) 及0.05 gram preservative methyl paraben (Sigma H-3647) 溶于100 ml Ca++/Mg++ free saline

血球計(jì)數(shù)盤(pán)及蓋玻片(Hemocytometer and coverslip)，計(jì)數(shù)器(counter)，低倍倒立顯微鏡 

粒子計(jì)數(shù)器(Coulter counter, Coulter Electronics)

3. 步驟：

3.1. 取50ml細(xì)胞懸浮液與50ml trypan blue (or Erythrosin bluish)等體積混合均勻于1.5ml小離心管中。

3.2. 取少許混合液(約15ml) 自血球計(jì)數(shù)盤(pán)chamber 上方凹槽加入，蓋上蓋玻片，于100倍倒立顯微鏡下觀察，活細(xì)胞不染色，死細(xì)胞則為藍(lán)色(或紅色- Erythrosinbluish)。

3.3. 計(jì)數(shù)四個(gè)大方格之細(xì)胞總數(shù)，再除4，乘以稀釋倍數(shù)(至少乘以2，因與trypan blue等體積混合)，后乘以104，即為每ml中細(xì)胞懸浮液之細(xì)胞數(shù)。若細(xì)胞位于線上，只計(jì)上線與右線之細(xì)胞(或計(jì)下線與左線之細(xì)胞)。

4 大格*細(xì)胞總數(shù)x 2 x 104 / 4= 細(xì)胞數(shù)/ml

*每一大格的體積= 0.1cm x 0.1cm x 0.01cm = 10-4 ml

3.4. 若不用血球計(jì)數(shù)盤(pán)，可用Coulter counter作自動(dòng)計(jì)數(shù)，惟無(wú)法辨別死細(xì)胞或活細(xì)胞。

3.5. 范例：

T75 monolayer culture制成10ml細(xì)胞懸浮液，取0.1 ml溶液與0.1ml trypan blue混合均勻于試管中，取少許混合液加入血球計(jì)數(shù)盤(pán)，計(jì)數(shù)四大方格內(nèi)之細(xì)胞數(shù)目。

活細(xì)胞數(shù)/方格：55, 62, 49, 59

死細(xì)胞數(shù)/方格：5, 3, 4, 6

細(xì)胞總數(shù)= 243

平均細(xì)胞數(shù)/方格= 60.75

稀釋倍數(shù)= 2

細(xì)胞數(shù)/ml：60.75 x 104 x 2 = 1.22 x 106

細(xì)胞數(shù)/flask：1.22 x 106 x 10ml = 12.2 x 106

存活率：225/243﹦92.6 %