一般我們購買商品化的primary antibody的時候,抗體的說明書中都會給我們一個推薦的抗體使用濃度。這個濃度在一定程度上來說,是過飽和的,可以滿足大多數(shù)實驗的染色需求。
但是因為是過飽和的濃度,這就帶來了一定程度的抗體浪費。而過量的抗體,也會大大提高樣本的自發(fā)熒光。
從另一個角度來看,因為廠家給出的推薦濃度都是基于一個特定的樣本濃度和樣本體積,所以在一些特殊的實驗中,比如樣本濃度或樣本體積過大的實驗,推薦的濃度就無法達到飽和滴加的要求。在這樣的前提下,推薦實驗用戶針對自己的實驗要求,zui好可以對抗體進行滴定。節(jié)約成本的同時,也可以讓自己的實驗更加。
滴定的原則:
1. 在進行滴定實驗前,應該遵守一個實驗一個變量的原則。既然滴定實驗要求的是摸索出準確的抗體工作濃度,那在制作樣本前,也需要對其他的實驗條件進行統(tǒng)一。而這些在滴定實驗中的條件,也應該沿用到后續(xù)的正式實驗中去。
2. 需要統(tǒng)一的條件:樣本,樣本數(shù)量/管,樣本體積/管,孵育條件等。總的來說,一個成功的滴定實驗,只應該有“抗體的終濃度不同”這一個實驗中的變量。
3. 滴定的稀釋倍數(shù):一般按照5倍稀釋的標準做5個梯度的原則做滴定實驗。也可根據(jù)自己的實驗進行適當調(diào)整。起點濃度的選擇則需要按照具體的實驗進行分析。比如,對于PBMC或者裂解后的全血、脾臟之類的樣本,活細胞比例高,單管樣本一般以1*10^6為上限??梢詮耐扑]用量開始,往下5倍稀釋,做5個梯度。但是有些原代細胞,比如涉及腫瘤免疫方面的樣本,活細胞比例低,免疫細胞的浸潤比例低,所以制備的樣本數(shù)量也會比較大,這個時候,也可以選擇超過推薦的濃度滴加,然后再進行梯度稀釋。
4. 滴定實驗完成后,通過計算染色指數(shù)(stain Index)確定zui佳抗體濃度。染色指數(shù)公式如下:
示例:
我們以anti-human CD3抗體舉例:在100ul全血樣本中,我們以該抗體推薦的用量5ul/tube 為高濃度,5倍稀釋,并設置5個梯度。高濃度至低濃度分別是5ul/100ul blood,1ul/100ul blood,0.2ul/100ul blood,0.04ul/100ul blood,0.008ul/100ul blood。通過計算,染色指數(shù)由高濃度到低分別為98.57,106.29,96.97,12.36,8.58。從染色指數(shù)上看,我們挑選出zui優(yōu)的抗體濃度為1ul/100ul blood。即為推薦用量的1/5。
用第三方軟件進行數(shù)據(jù)疊加可以一目了然。
注意事項:
1. 對于一些陽性表達幾乎100%的細胞,比如PBMC中的CD45,可以在樣本染色后少量加入未染色的細胞。
2. 對于表達量比較少的稀有細胞群體,在染色時,可加入該群細胞的父級細胞群的抗體。在設計多色實驗的滴定時,zui好可以分批滴定。將表達量高的抗體先進行滴定。確定zui佳濃度后,再滴定表達量少的抗體,并將已經(jīng)滴定好的抗體一同加入。比如我們在滴定外周血中的foxp3時,zui好可以加入已經(jīng)確定好濃度的CD4抗體。
3. 對于消化的組織來說,因為存在大量的死細胞,所以在這些樣本的滴定過程中,要先加入死活染料區(qū)分死活,再確定目標抗體的濃度。
4. 是否需要在滴定前blocking?取決于正式實驗。如果正式實驗是封閉的,那么滴定實驗也需要。
5. 遇到不同廠家,不同貨號,不同克隆號的抗體,需要重新滴定。
6. 滴定完成后,理論上只要cat號一致,lot號不一致,不需要重新滴定。但是為了保險起見,每一瓶抗體,特別是不同lot的抗體,zui好留一個樣本的抗體量,以方便日后的QC或者實驗復盤。
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